2022年1月11日，美国哈佛大学化学与化学生物系刘如谦教授团队在Cell Press细胞出版社期刊Cell《细胞》上报道了工程化无DNA病毒样颗粒的开发和应用，这种工具能有效地包装和递送碱基编辑或Cas9核糖核蛋白。
摘要
    以核糖核蛋白的形式在体内递送基因编辑剂的方法可以提供比核酸递送方法更安全的优势。报告了工程化无DNA病毒样颗粒（engineered DNA-free virus-like particles，eVLPs）的开发和应用，这种工具能有效地包装和递送碱基编辑或Cas9核糖核蛋白。为了克服基因编辑中包装、释放和定位的瓶颈，以VLPs为基础开发了第四代eVLPs，在几种主要的小鼠和人类细胞类型中成功介导了高效的碱基编辑。在eVLPs中使用不同的糖蛋白会改变它们的细胞趋向性。向小鼠一次注射eVLPs可以在多个组织中实现治疗水平的碱基编辑，在63%的肝脏编辑后，小鼠的血清Pcsk9水平降低了78%，遗传性失明小鼠模型的视觉功能也得到了部分恢复。在体外和体内试验中几乎没有发现eVLPs的脱靶编辑，这相比于AAV或质粒的递送是巨大的改进。这些结果说明，eVLPs是一种颇有前景的治疗性大分子载体，结合了病毒和非病毒递送的关键优势。   

   最近开发的基因编辑剂能够对生物体内的基因组DNA进行精确操作，大大增加了根治许多遗传疾病的可能性（Anzalone et al., 2020; Doudna, 2020; Newby and Liu, 2021）。碱基编辑（BEs）可以无需双链DNA断裂（DSBs）的情况下介导靶向性的单核苷酸替换，从而最大限度地减少编辑的不良后果，如核苷酸插入与缺失、大面积缺失、易位、染色体缺失或其他染色体异常等。原则上，同时进行胞嘧啶碱基编辑（CBEs）（Komor et al., 2016; Nishida et al., 2016）和腺嘌呤碱基编辑（ABEs）（Gaudelli et al., 2017）可以纠正大多数已知的致病单核苷酸变异（Anzalone et al., 2020; Rees and Liu, 2018）。曾成功应用BEs纠正致病点突变，并拯救小鼠和非人类灵长类动物的疾病表型（Koblan et al., 2021; Levy et al., 2020; Musunuru et al., 2021; Newby and Liu, 2021; Newby et al., 2021; Rothgangl et al., 2021; Suh et al., 2021; Yeh et al., 2020），这些结果强调了体内碱基编辑作为治疗策略的潜力。

   体内碱基编辑的广泛治疗应用需要安全有效的方法将BEs递送至多个组织和器官。迄今为止，效果最强大的体内传递BE方法涉及使用特定病毒，如腺相关病毒（AAVs），将BE编码的DNA递送至靶组织（Levy et al., 2020; Newby and Liu, 2021）。然而，DNA编码编辑剂的病毒递送会导致基因片段在转导细胞中的长时间表达，从而增加脱靶编辑的频率（Akcakaya et al., 2018; Davis et al., 2015; Wang et al., 2020; Yeh et al., 2018）。此外，病毒递送DNA可能会引起病毒载体整合到转导细胞基因组中，上述两种情况都会促进肿瘤发生（Anzalone et al., 2020; Chandler et al., 2017; Koblan et al., 2021）。病毒递送的这些缺点促使人们开发其他策略来实施BE的体内递送。
    在体内递送基因编辑剂的理想方法是直接递送蛋白质或核糖核蛋白（RNPs）而非DNA。RNPs在细胞中的存活时间较短，限制了脱靶编辑的机会。与递送BE编码的DNA或mRNA相比，递送BE RNPs可以大大减少脱靶编辑，而且通常不会牺牲目标编辑效率（Doman et al., 2020; Newby et al., 2021; Rees et al., 2017）。此前有研究报道在局部施用脂质包裹的BE RNPs后，在小鼠内耳和视网膜中成功地实现了碱基编辑（Jang et al., 2021; Yeh et al., 2018），但未有报道将BE RNPs递送至体内多个组织和器官的可推广策略。
    类病毒颗粒（VLPs）是能够感染细胞但不携带病毒遗传物质的病毒蛋白集合体，目前是一种有潜力且有前景的载体，可以将基因编辑剂作为核糖核蛋白（RNPs）递送（Campbell et al., 2019; Yao et al., 2021）。递送RNP的VLPs利用了病毒递送的效率和组织定位优势，但避免了与病毒基因组整合和编辑剂长期表达有关的风险。然而，迄今为止，现有的VLP介导的基因编辑剂RNPs递送策略只支持适度的编辑效率，对于体内疗效的验证有限（Campbell et al., 2019; Choi et al., 2016; Gee et al., 2020; Hamilton et al., 2021; Indikova and Indik, 2020; Lyu et al., 2019, Lyu et al., 2021; Mangeot et al., 2019; Yao et al., 2021）。事实上，据我们所知，目前还未有研究报道使用RNP包装的VLPs进行产后体内基因编辑的治疗水平。
    在此，描述了eVLPs的发展和应用，这是一个工程化的VLP平台，用于在体外和体内包装和递送治疗性RNPs（包括碱基编辑工具和Cas9核酸酶），从而比较病毒和非病毒递送策略的关键优势。VLP架构工程的迅速发展催生了第四代（v4）eVLPs，与先前报道的VLPs的初始设计相比，v4 eVLPs包装的BE RNP平均高出了16倍（Mangeot et al., 2019）。这些v4 eVLPs能够在多种细胞类型（包括多种永生细胞系、原代人和小鼠成纤维细胞、原代人T细胞）中实现高效的碱基编辑，并将脱靶编辑的概率降至最低；与之前报道的Cas9-VLP相比，v4 eVLPs还将Cas9核酸酶介导的插入或删除突变效率提高了4.7倍。在小鼠体内单次注射eVLPs，可对包括脑、肝脏和视网膜在内的多个器官实现各种靶点基因的有效碱基编辑。在肝脏中，eVLPs极大地降低了血清中的Pcsk9水平；在视网膜中，eVLPs部分恢复了遗传性失明小鼠模型的视觉功能。这些研究结果说明，eVLPs是一种能在体内瞬时递送基因编辑剂的平台，其编辑效率可达到治疗水平，并将脱靶编辑或DNA整合的风险降至最低，而且可能同样可以实现其他蛋白质和RNPs的高效体内递送。
讨论
    高效的工程化VLP平台，可以安全地递送RNPs，用于体外和体内的治疗性应用。通过发现并解决VLP递送效率的3个瓶颈——包装、释放和定位，将V4 eVLPs内的蛋白质负载平均提高了16倍，碱基编辑效率平均提高了8倍。研究结果表明，v4 eVLPs具有高度的通用性，适用于广泛的体外和体内编辑应用。我们还估计，除了BE和核酸酶之外，eVLP架构还可以作为一个模块化平台，用于递送其他有研究意义的蛋白质或RNPs。
    研究结果强调了使用合理的工程设计来进一步推进基因编辑剂递送平台的潜在治疗效果。本项工作中开发的eVLP平台使用了合理的工程结构，对其进行了特别定制，用以包装更多的基因编辑剂并提高粒子滴度。这些eVLPs可以在小鼠的多个器官和不同给药途径中介导治疗水平的体内碱基编辑，实现了迄今为止使用RNPs进行产后体内基因编辑的最高水平。
    单次静脉注射eVLPs可介导小鼠肝脏中Pcsk9的碱基编辑，其效率大于60%，与目前最先进的BE递送方法在同一目靶点上实现的效率相当，包括AAV介导的BE编码DNA递送（Rothgangl et al., 2021）和LNP介导的BE编码mRNA递送（Musunuru et al., 2021; Rothgangl et al., 2021）。与AAV介导的DNA递送和LNP介导的mRNA递送策略相比，eVLPs具有关键优势，展现出了广阔的治疗前景。
v4 BE-eVLPs架构对于在小鼠肝脏中实现强大的编辑至关重要，与之前报道的v1 VLPs设计相比，v4的体内编辑效率提高了26倍，强调了VLP架构对于体内编辑的重要性。使用v4 BE-eVLPs对Pcsk9进行碱基编辑的程度高于60%，被认为足以降低血清LDL和治疗高胆固醇血症（Musunuru et al., 2021）。
    在伯氏先天性黑蒙症（LCA）的小鼠模型中，单次视网膜下注射v4 BE-eVLPs可以有效地纠正致病点突变，并恢复其视觉功能。在这个模型中，eVLPs再次兼顾了较高的编辑效率和拯救水平，与之前使用病毒递送的方法实现的编辑效率和拯救水平相当甚至更高，包括慢病毒BE递送（Suh et al., 2021）和AAV介导的BE递送等（Jo et al., 2021）。眼睛的可治疗性及其免疫特权地位（Taylor，2009）可能更容易使新的递送方式转化为临床前和临床研究。数据为BE-eVLPs的治疗潜力提供了证据，其应用将有助于纠正导致眼部疾病的致病点突变。
    结合基因编辑剂的一次性治疗潜力和RNPs的瞬时性，可以有效减少不必要的脱靶编辑或DNA整合机会，有利于提高病毒转导的高效性及组织靶向性。因此，本研究结果表明，eVLPs是一种有吸引力的替代递送策略，可用于体内或体外递送BEs、核酸酶，以及其他有治疗意义的蛋白质。